DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA

 

Objetivo: Una prueba de hemoglobina es un examen que mide la cantidad total de hemoglobina en la sangre y casi siempre hace parte de un conteo sanguíneo completo (CSC)

Introducción: Es una proteína conjugada de color rojo integrantes de los eritrocitos entre un 31-34%. Existen varios métodos para determinación como hematina ácida, hematina alcalina, oxihemoglobina, carboxihemoglobina y cianometahemoglobina; éste último es el de elección por que es estable en soluciones diluidas, porque existen en el mercado estándares de cianometahemoglobina y porque las lecturas se pueden hacer en espectrofotómetro de uso común y corriente.

La sangre se hemoliza por agregado de un agente densoactivo, con el ferrocianuro de potasio se oxidan el átomo de fierro de ferroso a férrico para producir metahemoglobina. El cianuro de potasio estabiliza la metahemoglobina pasando de cianometahemoglobina. La cloración producida es directamente proporcional a la concentración de hemoglobina presente.

 

•  Tubos de ensayo de 13 x 100 ml
•  Pipetas de 1ml
•  Pipetas de Salí
•  Boquillas
•  Gradillas
•  Gasa
•  Celdas para espectrofotómetro
•  Sangre capilar o venosa con anticoagulante.

 Reactivos:

•  EDTA al 10 % (.07 ml por .5 ml de sangre)
•  Reactivo DE Drabkin:
•  Ferrocianuro de potasio
•  Cianuro de potasio
•  Bicarbonato de potasio
•  Solución estándar de cianometahemoglobina.

Procedimiento:

1.- En un tubo de ensayo, colocar 5 ml de reactivo de Drabkin
2.- Homogeneizar bien la sangre
3.- Llenar en sangre hasta la marca de la pipeta de Salhi
4.- Introducir la pipeta con sangre al tubo de ensayo y dejar caer la sangre, después mezclar bien la muestra.
5.- Se deja Reposar 10 min. Para la formación de cianometahemoglobina
6.- Calibrar primero el manómetro y después leer a 540 nanómetros en el espectrofotómetro contra un blanco de reactivo.
7.- comparar con la curva calibrada de estándares.

Valores de referencia:

Mujeres: 12 -14 gr/dl
Mujeres embarazadas: 11-14 gr/dl
Hombres: 13-19gr/dl
Recién nacidos: 13.19gr/dl

 

DETERMINACIÓN DEL HEMATOCRITO

 

Objetivo: Es el porcentaje del volumen total de sangre compuesto de glóbulos rojos. Es una medición compuesta por el tamaño y número de GR y casi siempre es parte de un conteo sanguíneo completo (CSC). Dicho conteo mide el número de glóbulos rojos (GR), glóbulos blancos (GB), la cantidad total de hemoglobina en la sangre y la fracción de la sangre compuesta de glóbulos rojos (hematocrito).

Introducción: El hematocrito mide el porcentaje del volumen de sangre total pero, ocupada solamente por los eritrocitos La sangre se extrae de una vena, usualmente de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de punción se limpia con un antiséptico y luego se coloca una banda elástica alrededor del antebrazo con el fin de ejercer presión y restringir el flujo sanguíneo a través de la vena, lo cual hace que las venas bajo la banda se llenen de sangre.Inmediatamente después, se introduce una aguja en la vena y se recoge la sangre en un frasco hermético o en una jeringa. Durante el procedimiento, se retira la banda para restablecer la circulación y, una vez que se ha recogido la sangre, se retira la aguja y se cubre el sitio de punción para detener cualquier sangrado.En los bebés o niños pequeños, el área se limpia con un antiséptico y se punza con una aguja o lanceta para luego recoger la sangre en una pipeta (tubo pequeño de vidrio), en una lámina de vidrio, sobre una tira de examen o en un recipiente pequeño. Finalmente, se puede aplicar un algodón o un vendaje en el sitio de la punción si el sangrado persiste.En el laboratorio, se toma un poco de la sangre y se introduce en una máquina centrífuga, proceso que impulsa las células hacia el fondo del recipiente. La porción celular se compara con la cantidad total de la sangre y se expresa en porcentaje. De hecho, dicha porción celular representa casi la totalidad de los glóbulos rojos, mientras que el porcentaje de glóbulos blancos es muy pequeño.

Material:

•  Tubo de Wintrobe que tiene 11.5 cm de largo x 3 mm de luz (hueco). Para el micro se usa el tubo capilar)
•  Pipeta Pasteur larga o Cánula
•  Centrífuga
•  Sangre capilar (micro) o venosa (macro) con anticoagulante

Procedimiento:

• Después de extraer la muestra de sangre se coloca en el tubo de ensayo con el anticoagulante.
• Homogenizar perfectamente la sangre haciendo girar el tubo.
• Utilizando la pipeta Pasteur o canula para llenar de sangre el tubo de Wintrobe exactamente hasta 10, no deben quedar burbujas de aire en el tubo
• Centrífuga a 3600 rpm. Durante 30 min.
• Ver resultado.

 

Valores de referencia:

H= 47 +- 2.5
M= 42+- 2.5

 

CUENTA ERITROCITARIA

 

Objetivo: Es un examen de sangre que mide el número de glóbulos rojos (GR) en la sangre y casi siempre se realiza como parte de un conteo sanguíneo completo (CSC) Consiste en diluir la sangre con el líquido de Hayem en una proporción exacta y luego examinar al microscopio una pequeña cantidad de la muestra colocada en la cámara de Neubauer, contando el número de elementos que se encuentran en el retículo de la cámara y mediante una operación matemática se obtiene la cifra total.

Introducción: Los glóbulos rojos sanguíneos transportan la hemoglobina que, a su vez, transporta el oxígeno. La cantidad de oxígeno recibida por el tejido depende de la cantidad y función de los glóbulos rojos y la hemoglobina. Normalmente, los glóbulos rojos sobreviven aproximadamente 120 días en la sangre, luego son removidos por células especializadas en el bazo y en el hígado. Cuando la eritropoyésis tiene lugar normalmente, su resultado final es la producción de una célula-eritrocito perfectamente diferenciada y apta para su función principal que es la de transportar oxígeno y CO2 . La falta de núcleo le confiere la virtud de acarrear el oxígeno sin consumir prácticamente nada de el; su forma bicóncava es la que mejor se presta para afrontar la hemólisis; su membrana no admite la salida de hemoglobina.

Material:

•  Tubos de ensayo de 13×100mm
•  Pipetas de Thomas para glóbulos rojos
•  Cámara de Neubauer
•  Boquillas
•  Microscopio
•  Gasa
•  Gradilla
•  Sangre capilar o venosa con anticoagulante

Reactivos:

•  EDTA (sal di sódica) al 10%
•  Líquido de Hayem:
•  Cloruro de mercurio 0.5 g
•  Cloruro de sodio 1.0g
•  Sulfato de sodio 5.0g
•  Agua destilada 100ml 

Procedimiento:

• llenar con sangre bien mezclada la pipeta de Thoma, hasta la marca 0.5. (Las pipetas están constituidas por dos porciones capilares y un bulbo central. El tubo capilar inferior está dividido en 10 partes iguales con marcos de0.5 y 1.0.En el interior del bulbo existe una perlita de plástico (roja), para favorecer la mezcla de la sangre con el líquido y en el capilar superior hay una marca 101)
• Se limpia cuidadosamente con gasa la parte externa de la pipeta para no contaminar el liquido de harem al introducir la pipeta.
• Llenar la pipeta con líquido de Hayem hasta la marca 101.
• Agitar durante 3 minutos para mezclar perfectamente.
• Limpiar y Colocar el cubre hematímetro sobre la cámara.
• Desechar las primeras 3-5 gotas de la pipeta y llenar la cámara por uno de los bordes del cubrehematímetro.
• Se deja que el líquidos penetre lentamente entre la cuadrícula y el cubrehematímetro hasta que la plataforma de recuento este completamente cubierta de muestra.
• Dejar reposar de 3-5 minutos sobre la platina del microscopio.
• Con objetivo de 40x se encuentra los eritrocitos contenidos en 80 cuadros pequeños; uno central y cuatro de los extremos.

Cálculos:
Si se considera que el retículo central tiene 400 cuadritos se realizará el siguiente cálculo.
N x 200 x 10 x 400 = N x 10,000
80
N= número de eritrocitos contados
200= factor de dilución
10= corrección x altura de la cámara
Valores de referencia:
Hombres 4.5 x 106 - 5.5 x 106 mm3
Mujeres 4.3 x 106 - 5.0 x 106 mm3

 

CUENTA LEUCOCITARIA

 

Objetivo: La sangre se diluye 1:2 con una solución hipotónica de ácido acético que destruye a los eritrocitos.

Introducción: La leucopoyésis es un proceso que se lleva a cabo con gran actividad, ya que si el número de granulositos circulantes de ninguna manera es comparable al de los eritrocitos, en cambio se estima que la sobre vida de los neutrófilos no excede de 5 días, de las cuales solo pasan 10 hrs. en la sangre circulante.

El azul de metileno permite reconocer fácilmente el líquido y observar mejor los glóbulos blancos, a los que tiñe ligeramente

Los normoblastos no se destruyen, por lo que se deben tomar en cuenta para corregir los resultados Sirven para clasificar a los eritrocitos de acuerdo a su tamaño y contenido de hemoglobina Se utiliza el hematocrito y la cuenta de eritrocitos para calcular los índices:

• VCM (Volumen Corpuscular Medio)
• CMHC (Concentración Media de la Hemoglobina Corpuscular)
• HCM (Hemoglobina Corpuscular Media)

Es posible medir de manera directa los índices eritrocitarios en contadores celulares automáticos. Por ejemplo: el coulter; al pasar los eritrocitos a través de un orificio en el cual fluye una corriente eléctrica.

Material:

•  Tubos de ensayo de 13 x 100mm
•  Pipeta de Thoma para glóbulos blancos
•  Cámara de Neubauer
•  Microscopio
•  Boquillas
•  Gasa
•  Sangre capilar o venosa con anticoagulante

Reactivos:

•  EDTA (sal disódica) al 10 %
•  Liquido de Turk:
•  Ácido acético glacial 3.0 ml
•  Agua destilada c.b.p. 100 ml
•  Adicionar 1 o 2 gotas de azul de metileno

Procedimiento

• 1.- Llenar la pipeta con sangre bien mezclados hasta la marca de .5
• 2.- Limpiar cuidadosamente la pipeta por fuera
• 3.- Aforar con solución de Turk hasta la marca de II
• 4.- Agitar la pipeta durante 3 min.
• 5.- Se desechan las primeras 4 o 5 gotas de la pipeta y se carga la cámara de Neubauer
• 6.-Dejar reposar la cámara durante 3 min.
• 7.- En el microscopio con el objetivo de 10x, se cuentan los leucocitos presentes en los cuatro cuadros grandes de los extremos
• 8.- Multiplicar por 50 el promedio de los leucocitos con la siguiente fórmula Células contadas x 20 (dilución) x 10 (corrección de altura) /4 (núm. De cuadro de 1mm contados)

Este factor varía si se cambia la dilución y o el número de cuadros contados

-En caso de existir normoblastos (eritrocitos nucleados) deberá hacer la cuenta diferencial leucocitaria

Valores de referencia:

Leucocitos:

• Adultos: 5000 - 10 000 / mm3
• Recién nacidos: 10 000 - 25 000 / mm3
• Niños: 8000 - 15 000

 

CUENTA DIFERENCIAL LEUCOCITARIA

Introducción:

Se realizará este proceso en caso de existir normoblastos (eritrocitos nucleados) en la cuenta leucocitaria

Por este proceso se podrá decir cuantos normoblastos hay por cada 100 leucocitos. Ejemplo:

Si hay 28 normoblastos por cada 100 leucocitos se aplica la siguiente relación:

128 - 100
12000 — x
x = 9375 leucocitos

La cuenta leucocitaria diferencial es el conteo del número de los distintos tipos de leucocitos. Identifica a los individuos con una mayor susceptibilidad a la infección

Técnica:

La cuenta leucocitaria total circulante se divide en 5 tipos de leucocitos:

• neutrófilos (en banda y segmentados). Su citoplasma es incoloro y tiene múltiples granos color gris; o puede ser multilobulado, que posee cuatro lóbulos nucleares.
• eosinófilos: es redondo u ovalado, el núcleo posee no más de tres lóbulos y en el citoplasma se observa no mas de 20 granos color naranja.
• basófilos: se caracterizan por sus grandes granulaciones azul oscuro. Estos gránulos son hidrosolubles.
• linfocitos: Su citoplasma es azul pálido y la cromatina nuclear color púrpura azulado oscuro; casi no posee citoplasma.
• monocitos: su núcleo suele ser arriñonado. Contiene una red de cromatina. El citoplasma se tiñe de un color azul grisáceo y contiene finas granulaciones color rosa.

 

Valores de referencia:

Neutrófilos:

*En banda 0-11%
*Segmentados 25-62%
Eosinófilos: 0-2%
Basófilos: 0-1%
Linfocitos: 25-40%
Monocitos: 3-12%

 

TINCIÓN DE WRIGHT

Fundamento: La tinción de Wright es una tinción de tipo Romanowsky. Es extremadamente importante en el laboratorio de hematología este tipo de tinción, ya que puede obtenerse una cantidad abundante de información a partir del examen de un frotis de sangre periférica bien teñido Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B.

La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y.

Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico.

La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas.

Material:

•  Frotis sanguíneo
•  Agua destilada
•  Eosina B
•  Eosina Y
•  Azul de metileno
•  Alcohol metílico

Procedimiento:

1.- Hacer un frotis sanguíneo, ni demasiado delgado, ni que llegue al extremo del portaobjetos
2.- Fijar el frotis con alcohol metílico y dejar secar
3.- Sumergir el portaobjetos en el hemoclorante 1, durante 5 o 6 segundos
4.- Lavar con Buffer 7.2 y sacudir para eliminar exceso
5.- Sumergir por 6-8 segundos en el hemoclorante 2
6.- Lavar con buffer 7.2 y dejar secar
7.- Observar al microscopio

 

CUENTA PLAQUETARIA

 

Introducción: Las plaquetas son fragmentos de una célula llamada megacariocito, se encuentran unas 250 mil x mm3 , su vida media es de 9.5 días, sus funciones principales son: coagulación y mantener la integridad de las paredes de los vasos.

Miden de 3-4 micras de diámetro, son redondeadas, se pueden observar con una tinción azul de crisil brillante, no tienen núcleo; el número de plaquetas es el resultado el equilibrio entre el numero de plaquetas producidas en la médula ósea y las utilizadas, también de la pérdida o destrucción de la sangre periférica.

 

Material:

•  sangre venosa con EDTA al 10%
•  tubo de ensayo de 13 x 100ml
•  pipeta de Thoma para glóbulos rojos
•  cámara de Neubauer
•  caja de petri
•  gradilla

Reactivos:

•  Colorante de azul de cresil brillante
•  EDTA al 10 %

Procedimiento:

1.- Asepsia y obtención de la muestra Adultos o niños:
La sangre se extrae de una vena (punción venosa), usualmente de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de punción se limpia con un antiséptico y luego se coloca un torniquete.

Bebés o niños pequeños:
En los bebés o niños pequeños, el área se limpia con un antiséptico y se punza con una aguja o lanceta para luego recoger la sangre en una pipeta.

2.-Descargar la pipeta en el líquido diluyente

3.-Enjuagar y llenar hasta la marca 1 y con la , muestra de sangre hasta 1.1

4.-Mezclar de 3-5 minutos

5.-Tirar las primeras 3-5 gotas

6.-cargar la cámara cuenta glóbulos

7.- dejar reposar 5 minutos, en una caja petri con un papel filtro húmedo

8.- Dejar reposar la cámara

9.- observar por le objetivo 10x

10.- las plaquetas aparecen como cuerpos coloreados en todo el cuadro central.

Cálculo:

Numero de plaquetas contadas x 1000

Valores de referencia:

150 mil- 450 mil /mm3

Cuidados durante el examen:

Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Después, puede haber una sensación pulsátil.

El conteo plaquetario se puede ver afectado por muchos estados patológicos. Igualmente, se puede medir para evaluar la causa de un sangrado excesivo.

Entre los medicamentos que pueden disminuir el conteo de plaquetas están: agentes quimioterapéuticos, cloranfenicol, colchicina, agentes bloqueadores H2, heparina, hidralacina, indometacina, isoniacida, quinidina, estreptomicina, sulfonamida, diuréticos tiazídicos y tolbutamina.

 

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